Cloning and characterization of the dna polymerase I from thermophilic Geobacillus caldoxylosilyticus TK4


Thesis Type: Doctorate

Institution Of The Thesis: Karadeniz Technical University, Fen Bilimleri Enstitüsü, Turkey

Approval Date: 2007

Thesis Language: Turkish

Student: CEMAL SANDALLI

Supervisor: Ali Osman Beldüz

Abstract:

Bu çalısmada, Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 (Gca TK4) susundan DNA polimeraz I geni (DNA pol I) klonlandı ve Escherichia coli'de (E. coli) ekspres edilerek bazı biyokimyasal ve fiziksel özellikleri incelendi. Gca TK4 DNA polimeraz I genine ait tüm nükleotit sırası dejenerat primerler ve ters PZR reaksiyonu ile tamamlandı ve genin stop kodonu ile birlikte 2637 bç oldugu belirlendi. Amino asit sırası bakımından diger Bacillus ve Geobacillus DNA polimeraz I enzimlerine %89 benzer oldugu bulundu. 5'3' nükleaz ve polimeraz aktivitesi için korunmus amino asitlere sahip oldugu, 3'5' ekzonükleaz aktivitesi için gerekli korunmus amino asitlere ise sahip olmadıgı belirlendi. Gen pET15b vektörüne klonlanarak, E. coli BL21(DE3)pLysS susunda ekspres edildi ve protein sıcaklık uygulaması DEAE-selüloz ve BioRex 70 katyonik kromatografi ile saflastırıldı. Rekombinant enzimin optimum aktivite gösterdigi sıcaklıgının 55?60 ºC, optimum pH'sının ise 7,5 ile 9,0 arasında oldugu tespit edildi. Enzimin 70 ºC üzerindeki sıcaklıklarda 5 dakika bekletilme sonucu aktivitesini kaybettigi belirlendi. DIG-dUTP'yi normal dNTP gibi kullanarak DNA sentez aktivitesi gösterebildigi ve kalıp/primer kompleksinde, kalıp zincir üzerindeki son nükleotiti ekleyerek 3' ucuna ait boslukları doldurabildigi belirlendi. DNA-bagımlı DNA polimeraz aktivitesi için Mg+2 metal iyonuna (7 mM), RNA-bagımlı DNA polimeraz aktivitesi için Mn+2 metal iyonuna (6 mM) ihtiyaç duymaktadır. Mg+2 ile özgül aktivitesi 495,000 ünite/mg olarak hesaplandı. KDDNA degeri 0,192 nM, KD dNTP degeri ise 21,64 ?M olarak belirlendi. Kpol degeri ise 24,99 s?1 olarak belirlendi. Hem çift zincir DNA hemde tek iplik DNA ile herhangi bir 3'5' ekzonükleaz aktivitesinin olmadıgı, sarkık tek iplik 5' uç tasıyan DNA örnekleri ile 5' nükleaz aktivitesinin KD degerinin 2,35 nM oldugu, enzimin çogunlukla 5' sarkık ucu ve sarkık ucun basladıgı noktada eslesme yapmıs iki nükleotit arasından kesim yaptıgı belirlendi. Gca TK4 DNA pol I yaban tip enzimin ddNTP'ye duyarlı olmadıgı ancak 712 numaralı Fenilalanin amino asiti Tirozin amino asitine dönüstürüldügünde elde edilen mutant enzimin dNTP'ye olan ilgisinin nerede ise tamamen ddNTP'ye dönüstügü belirlendi. Enzimin zincir uzaklastırma aktivitesine sahip oldugu ve 721 numaralı Tirozin amino asiti Fenilalanin amino asitine dönüstürüldügünde ise aktivitenin arttıgı belirlendi.