Cloning, expression and characterization of the aluminium resistance gene of Anoxybacillus gonensis G2


Thesis Type: Doctorate

Institution Of The Thesis: Karadeniz Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji, Turkey

Approval Date: 2006

Thesis Language: Turkish

Student: Fatih Şaban BERİŞ

Principal Supervisor (For Co-Supervisor Theses): ALİ OSMAN BELDÜZ

Abstract:

Bu çalışmada, 100 mM'a kadar Al+3'e dirençli olduğunu belirlediğimiz,Anoxybacillus gonensis G2 termofilik bakterisinin alüminyum dirençlilik genine aitözellikler araştırılmıştır. lgili gen klonlandıktan sonra DNA dizin analizi yapıldı ve aminoasit sırası tespit edildi. Gen dizisi, Genbank ile karşılaştırılarak, gen hakkında detaylıbilgilere ulaşıldı. Karşılaştırmalar sonucunca ATPaz'lara olan benzerliği nedeniyle, ilgiligen önce bir ekspresyon vektörüne klonlandı ve bu sayede bol miktarda üretilereksaflaştırıldı. Saf enzimin ATPaz aktivitesi belirlendikten sonra, bu aktiviteye aitbiyokimyasal karakterizasyon çalışmaları yapıldı.A. gonensis G2 bakterisinin sahip olduğu alüminyum dirençlilik geni, 666 baz çiftibüyüklüğünde ve 222 amino asit içerdiği bulundu. AlR geninin Genbank karşılaştırmalarıda hem alüminyum dirençliliği genlerine yüksek oranda benzediğini hem de ATPazbenzerliğini ortaya koydu. Enzimin çalıştığı optimum pH 6,0 ve sıcaklık değeri ise 73ºColarak belirlendi. Enzimin Km değeri 10 µM, Vmax değeri ise 7,2 ünite olarak tespit edildi.Zn+2 ve Al+3 iyonlarının enzimin aktivitesini arttırdığı, Ag+, Li+, Mn+2, Co+2, Cu+2 ve Cd+2iyonlarının ise aktiviteyi azalttığı bulundu. 100 mM Li+, 100 mM Co+2 ve 200 mM Cu+2iyon konsantrasyonlarının aktiviteyi tamamen inhibe ettiği belirlendi. EDTA'nın aktiviyi80 mM konsantrasyonda % 62 ve sodyum azidürün 50 mM konsantrasyonda % 86azalttığı, 200 mM β-merkaptoetanolün ve 7 mM Ouabainin konsantrasyonlarının iseenzimi tamamen inhibe ettiği tespit edildi. Enzimin kristallendirilebilmesi için en uygunşartların, % 10 izopropanol ve % 22 PEG-4000 içeren 1 M HEPES (pH 7,5) tamponunolduğu tespit edildi. Enzimin, bu şartlar altında iğne şeklinde kristal yapılar oluşturduğugözlendi.