Akademik Veri Yönetim Sistemi
22. Uluslararası Katılımlı Ulusal Biyoteknoloji Kongresi, Ankara, Türkiye, 20 - 22 Ekim 2023, ss.2
Giriş
Enkapsülin, bakterilerde doğal olarak üretilen protein yapılı nanokompartmanlardır. Enkapsülin protomerleri, kendiliğinden bir araya gelerek 21-42 nm çapında kapsit benzeri bir yapı oluşturur1. ve Peroksidaz, Flp, IMEF gibi katalitik aktiviteye sahip spesifik kargo proteinlerini kapsülleyerek, enzimlerin stabilitesini ve aktivitesini artırırlar2,3. Fizyolojik olarak, bakteriyi oksidatif strese karşı korur ve mineral depolarlar3. Enkapsülinlerle, ilaç hedefleme, aşı dizaynı ve biyoreaktör üretimi gibi çeşitli nanoteknolojik çalışmalar yapılmıştır4. Bu kapsül yapılar, ileri teknolojik gelişmeler için ümit vadeden biyoteknolojik araçlardır.
Bu çalışmada, Jiangella aurantiaca DyP-enkapsülin (JauDyP-Enc) sistemi karakterize edilmiştir.
Gereçler ve Yöntemler
Bu çalışmada, J. aurantiaca enkapsülin (JauEnc) ve kargo protein (JauDyP) genleri pET28a’ya klonlanarak, E. coli BL21’de ekspres edildi ve proteinler, metal iyon kromatografisi ile saflaştırılıp, SDS-PAGE ile görüntülendi. DLS ve TEM ile enkapsülinin (kapsülün) yapı analizleri gerçekleştirildi. DyP’nin kapsülasyonu, native jel ve zimogram ile görüntülendi. pH, sıcaklık, denatüre edici ajanlar metal iyonları ve Tripsinin enkapsülin (kapsül) üzerindeki etkisi araştırıldı. DyP enziminin ABTS substratı ile yapılan spektrofotometrik analizleri ile optimum pH’sı, optimum sıcaklığı ve kinetik parametreleri belirlendi. Ayrıca organik çözücü, deterjan, metal iyonlarının DyP enzimine etkileri araştırıldı. DyP ve enkapsülinin belirlenen fizyolojik şartları baz alınarak, DyP’nin enkapsülin ile in vitro kapsülasyonu sağlandı. Aynı analizler kapsüllenen DyP için de gerçekleştirilerek, kapsüllenmiş ve kapsüllenmemiş DyP enzim karakterleri karşılaştırıldı.
Bulgular
JauDyP ve JauEnc protomeri, sırasıyla 36 kDa ve 29 kDa, JauEnc kapsülün çapı 24 nm olarak belirlendi. Native jel ve zimogramda kapsül içindeki JauDyP aktivitesi beklendiği gibi boş kapsülle aynı pozisyonda gözlendi. Kapsülün, JauDyP aktivitesini, metal CuSO4 ve HgCl2 iyonlarına karşı %100 ve %85; organik çözücü bütanole karşı ~%70 ve gliserole karşı ~%90 koruduğu belirlendi. Kapsülün, JauDyP’yi Tripsin degredasyonundan koruduğu, SDS-PAGE ile gösterildi. Kapsülsüz JauDyP, 48. saatte aktivitesinin tamamını kaybederken, kapsüllünün ise %50’sini koruduğu belirlendi. Kapsülsüz ve kapsüllü JauDyP’nin kinetik parametreleri, sırasıyla, 0,0143 mM ve 0,017 mM, Vmax değerleri ise, sırasıyla, 7,7529E-06 U/mg ve 7,65568E-06 U/mg olarak belirlendi.
Sonuç ve Tartışma
JauDyP, JauEnc protomerleriyle in vitro’da pH aracılı oluşturulan kapsül içine alınarak, kapsülün ve JauDyP enziminin karakterizasyonu yapıldı. Enkapsülinin (kapsülün) dirençli bir yapı olduğu, DyP’yi koruduğu ve kararlılığını artırdığı belirlendi.
Anahtar Kelimeler: Enkapsulin, Nanokompartman, DyP, Peroksidaz