Noonan Sendromuyla İlişkili Homozigot LZTR1 p.I821T Amino Asit Değişiminin HEK293 Hücrelerinde Hidrojen Peroksit İle Apoptoz Tetiklenmesine Direnç Sağlayıcı Etkisi Ve Mekanizması

Giriş ve Amaç: Leucine-Zipper-Like Transcriptional Regulator 1 (LZTR1) proteininin RAS/MAPK yolağında yer aldığı yakın zamanda belirlenmiştir. LZTR1'in BACK-2 domainin işlevi bilinmemektedir. BACK-2 domaininde yer alan homozigot p.V773M amino asit değişimi prenatal dönemde sıklıkla ölümle neticelenen Non-Immune Hydrops Fetalis (NIHF) ile homozigot p.I821T değişimi konjenital bir hastalık olan Noonan Sendromu (NS) ile ilişkilendirilmiştir. Apoptoz, sağlıklı fetal gelişimde rol oynayan programlı hücre ölümüdür. Bu çalışmanın amacı, yabanıl tip (WT) LZTR1 proteininin ve LZTR1’in BACK-2 domainindeki amino asit değişimlerinin apoptoz sürecindeki fonksiyonel etkilerini araştırmaktır.

Gereç ve Yöntem: Flag etiketli LZTR1-WT, p.V773M ve p.I821T proteinlerini kalıcı olarak ifade eden HEK293 Flp-In hücreleri hazırlandı. Stabil hücrelerde hücre popülasyonunun ikilenmesi (PD) analizleri, hidrojen peroksit (H2O2) ile apoptoz indüklenmesi, hücre döngüsü ve Annexin V analizleri ve western blotlama deneyleri gerçekleştirildi. 400 μM H2O2 ile 10 saat muameleyle H2O2 verilen tüm gruplarda S fazındaki hücre oranının iki katına çıktığı belirlendi. Annexin V boyamaları, transfeksiyon yapılmayan, LZTR1-WT ve LZTR1-p.V773M ifade eden hücrelerde H2O2 muamelesiyle apoptotik hücre yüzdesinin istatistiksel olarak anlamlı değişim gösterirken LZTR1-p.I821T proteinini ifade eden hücrelerde apoptotik hücre yüzdesinin değişmediğini ortaya koydu. PD analizleri LZTR1-p.I821T varlığında hücre büyüme hızının istatistiksel olarak anlamlı düzeyde arttığını gösterdi. Western blotlama deneyleri transfeksiyon yapılmayan hücrelerde, LZTR1-WT veya LZTR1-p.I821T proteinlerini ifade eden hücrelerde H2O2 muamelesiyle p53 protein düzeylerinin artıp LZTR1-p.V773M varlığında değişmediğini, fosfo-p53 (S15) düzeylerinin transfeksiyon yapılmayan ve LZTR1-p.I821T ifade eden hücrelerde artarken LZTR1-WT ve p.V773M ifade eden hücrelerde değişmediğini, Survivin seviyelerinin transfeksiyon yapılmayan ve LZTR1-WT ifade eden hücrelerde azalırken LZTR1-p.V773M ve LZTR1-p.I821T varlığında Survivin miktarının değişmediğini, anti-apoptotik BCL2 protein düzeyinin H2O2 uygulanan ve LZTR1-p.I821T ifade eden hücrelerde yükselirken BAX protein düzeyinin LZTR1-p.I821T varlığında artmadığını, aktif Caspase-3 protein seviyelerinin H2O2 uygulanan transfeksiyon yapılmamış ve LZTR1-WT ifade eden hücrelerde artarken LZTR1-p.V773M veya LZTR1-p.I821T ifade eden hücrelerde artmadığını ve apoptoz tetiklendiğinde LZTR1-WT seviyesinin azaldığını gösterdi.

Bulgular ve Sonuç: NS ilişkili LZTR1-p.I821T ifade eden hücrelerin H2O2 ile apoptoz tetiklenmesine dirençli olduğuna, bu süreçte p53/BCL2/BAX aksisinde anti-apoptotik BCL2 protein düzeyin artmasının rolünün olabileceğini ve LZTR1’in BACK-2 domainindeki NIHF ve NS ile ilişkilendirilen varyasyonların apoptoz üzerinde farklı fonksiyonel etkileri olduğuna işaret etmektedir. Bulgularımızın, LZTR1 proteininin biyolojik fonksiyonlarının ve LZTR1 ile ilişkili hastalıkların moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına katkı sağlabileceği değerlendirilmektedir.