Modification of hydrogen metabolism for improved ethanol production in thermophilic bacteria
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Karadeniz Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Fen Bilimleri Enstitüsü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2018
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: AYŞENUR EMİNOĞLU
Danışman: Ali Osman Beldüz
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Lignoselülozik biyokütle, doğada en fazla bunan organik materyaldir. Bol miktarda bulunan lignoselülozik biyokütlenin etanol gibi sıvı yakıtlara dönüştürülmesi enerji güvenliğinin arttırılması, ticaret açığının azaltılması, sera gazları emisyonunun düşürülmesi ve fiyat kararlılığının sağlanmasında önemli bir seçenek sunmaktadır. Konsolide Biyoproses (KBP) lignoselülozun enzim eklenmeksizin tek bir adımda istenilen ürünlere dönüştürülmesidir. Bu yöntem özellikle lignoselüloz karbohidratlarını doğal parçalama kapasitesine sahip mikroorganizmaların genetik olarak modifiye edilmeleri ile zorlu endüstriyel süreçlere dayanıklı, yüksek verim ve derişimde yakıt üretebilen mikrorganizmalara dönüştürülmelerine olanak sağlaması açısından son yıllarda giderek artan bir ilgiyle karşılanan bir araştırma sahasına dönüşmüştür. Bu amaçla çok çalışılan organizmaların başında Thermoanaerobacterium saccharolyticum ve Clostridium thermocellum gelmektedir. T. saccharolyticum; ksilanı ve biyokütle türevli şekerlerin büyük bir çoğunluğunu yüksek sıcaklık derecelerinde fermente edebilen, hemiselülolitik anaerob termofillerden bir tanesidir. C. thermocellum ise, T. saccarolyticum'un aksine fermentasyon için kristalize selülozu parçalayabilen ancak beş C'lu şekerleri kullanamayan selülolitik bir anaerob termofildir. Tanımlanan tüm termofilik sakkarolitik anareoblar, fermentasyon sonucunda etanolün yanı sıra asetat, laktat, amino asit, CO2, H2 ve başlıca fermentasyon ürünlerini üretmektedirler. T. saccharolyticum ve C. thermocellum gibi termofillerde asetik asit pirüvat ferrodoksin oksidoredüktaz (PFOR), fosfat asetil transferaz ve asetat kinaz vasıtası ile pirüvattan meydana gelirken, laktik asit L- laktat dehidrojenaz vasıtası ile oluşmaktadır. Pirüvatın, PFOR vasıtası ile asetil-CoA'ya dönüşümü sonucu indirgenmiş ferrodoksin üretilir. Ferrodoksinden gelen elektronlarhidrojen üretiminde kullanıldıkları gibi etanol üretiminde de kullanılabilir ve teorik olarak hidrojen üretimindeki bir düşüşün etanol üretiminde eş değerde bir artışa, aynı şekilde hidrojen üretiminde bir artışın etanol üretiminde eş değerde bir düşüşe neden olması beklenir. Yapılan bu çalışmada; yaban tip olan T. saccharolyticum 'da hfsABCD operonunu oluşturan hfsA, hfsB, hfsC ve hfsD genlerinin teker teker delesyonu yapılarak sellobioz fermentasyonu sonucu etanol ve hidrojen üretiminde meydana gelen değişiklikler karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiş ve hfsA ve/veya hfsB gen delesyonları sonucu T. saccharolyticum'da etanol üretiminin yaban tipe oranla yaklaşık 1.8 kat artış gösterdiği tespit edilmiştir. Enzim aktivite deneyleri etanol üretiminin yüksek olduğu mutant suşlarda alkol dehidrojenaz (AdhE) aktivitesinin yaban tipe göre yaklaşık 2.0 kat artış gösterdiğini ortaya koymuştur. Transkriptomik ve proteomik çalışmalar etanol üretiminde ki bu artışın, kısmen de olsa adhE geninin ekspresyonunda bir artışla ilişkili olduğunu göstermiş ve bu da hfsB ve adhE arasında düzenleyici bir mekanizmanın varlığını düşündürmüştür. Ayrıca hfsB gen delesyonunun hfs-benzeri hidrojenaz içeren, çalışılan diğer termofilik anaeroblarda da etanol üretiminde artışa neden olduğu ortaya konmuştur. Bunlar içerisinde Thermoanaerobacterium xylanolyticum ve Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum mutant suşlarından literatürde bugüne kadar bildirilen en yüksek etanol verimi elde edilmiştir. Bu da hfsB gen delesyonunun hfs-benzeri hidrojenaz içeren diğer mikroorganizmalarda da etanol üretiminin artırılması amacı ile genel bir genetik mühendisliği yöntemi olarak kullanılabileceğini ortaya koymuştur. hfsB geninde nokta mutasyonları taşıyan T. saccharolyticum suşu (LL1186) hfsABCD operonunun (hfs*), ΔhydGΔech C. thermocellum suşunda (LL1147) üç farklı promotor altında heterolog ekspresyonu sonucu elde edilen mutant suşlarda ise kontrol suşa nazaran etanol üretiminde herhangi bir artış elde edilemediği görülmüştür.